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以灌流方式培养CHO细胞系 一次性生物反应器 技术回顾
点击次数:1061 发布时间:2017-11-20

   一次性使用的组件为生物制品的生产带来了很多优势。它们干净、买来即用、不需要灭菌,因此也就减少了如冲洗用水系统(WFI)和蒸汽发生器检修的需求。一次性的组件不能用于后续的操作,消除了工艺流程运行之间交叉污染的可能性。因为减少或摈弃了对不锈钢设备的需求,也可以避免了设备组装的长周期。系统的复杂度降低,因而所涉及的工程需求也同样减少。再也无需在位清洗(CIP)或在位灭菌(SIP)操作,以及相关的管道、阀门、控制器或容器的压力等级。此外,一次性组件的使用还降低了验证的复杂度。因为几乎没有可反复使用的组件,也就没有什么项目需要跟踪,也就节省了大量的灭菌、清洁验证研究。zui后,通过消除了坚固的管道系统和固定发酵罐的限制,一次性组件还有利于实现更快速的改装以便用于新流程的运行。一次性组件的使用可在劳力、设备、厂房设计以及验证方面实实在在地节省可观的费用。一次性的组件包括:生物处理袋、管、囊式过滤器、切向流舱、生物反应器、层析舱及混合系统。

1. 波浪生物反应器。20/50EH 系统。

一次性生物反应器的使用及放大

在某些应用中,灌流式细胞培养比分批和补料分批工艺更具优势。操作方式的选择是根据工艺规程所指定的综合需求。工艺的优化常常是评估哪种类型生产zui有效的*途径。分批是zui常用的以终点为依据的生产方式。在分批生产方式中,生物反应器在接种、培养并达到指定的细胞密度和产品浓度的时即收集细胞上清。在补料分批工艺中,在生产流程的晚期进行补加原料以改进细胞活力,增加总的产率。在灌流方式中,原料溶液持续加入生物反应器中,用过的培养基也不断排出。以灌流方式来运行工艺能增加培养的持久性和细胞密度,反过来又增加了整体的生产率3,4,9。我们的目的蛋白,AZ-IL2B,是一个二聚体融合蛋白,由人IL-2 连接人免疫球蛋白特异针对pIgR scFv 区域而组成6。这个融合蛋白zui适合灌流方式的生产。细胞产生的蛋白水平较低,而且AZ-IL2B 很脆弱,特别是在37º C。灌流生产所带来的生产容量增加,以及缩短了不稳定蛋白在反应器中停留的时间,都有助于实现更高的产量。本文总结了Wave Biotech, LLC所生产的一次性生物反应器以灌流方式从25 工作体积放大至500 工作体积的生产放大结果。我们将比较25 升、100 升和500 工作体积的三个不同系统。对于每个生物反应器的运行都测定了以

下参数,包括:细胞数量和活力、产生的蛋白数量、葡萄糖和乳酸水平。对每个系统间的这些参数进行了比较,结果显示三个不同体积的生物反应器是相当的。

材料与方法生物反应器描述

每个生物反应器由一个灵活的、一次性的、预先灭菌的塑料袋组成, 这个塑料袋称为细胞袋(Cellbag®)。在操作中,细胞袋放置在摇摆平台上,充入部分培养基(图1)。细胞袋的剩余体积则充入了由二氧化碳(CO2)和氧气(O2)组成的气体混合物。这些气体是通过预留在细胞袋上的无菌过滤入口来添加的。空气流提供了氧气,以及控制pH和去除二氧化碳所需的气体交换。废气则通过另一个无菌过滤器和背压控制阀排出。背压控制阀确保了细胞袋在任何空气流下总是充满的。阀门也防止了细胞袋的过度膨胀以及爆炸的可能。填充空气的顶部空间占据了细胞袋被填满时的一半体积.例如,一个充满时是50 升总体积的细胞袋将包含25 细胞悬液和25 空气。空气在培养时持续地穿过顶部空间。流程中的气体,如CO2O2,以可控的方式与空气混合。液体混匀以及气体的物质传递是通过来回摇动细胞袋而实现的。这种摇动在气相和液相对分界面产生了波动。这些波动大大增加表面积,能提高气体转移。波浪运动还促进细胞和颗粒离开底部悬浮(防止沉降)以及大面积混匀,同时不会给细胞带来任何伤害。摇动可以通过设定摇摆角度和每分钟的摇动次数来控制。这些参数必须根据细胞袋中的使用体积来确定。细胞袋的温度可通过加热器来控制,此加热器位于设备的底盘,对细胞袋的底部进行加热。加热器是由同样位于单元的底盘的非插入式的温度传感器来调节8。另外还设计了特别的接口,以供无菌加料及样品的取出,而无需将生物反应器置于层流柜中。可用无菌的管道连接器将培养基、缓冲液和葡萄糖储存液加入系统中。使用的生物反应器分别为20/50EH 系统、200 系统和1000 系统(WaveBiotech, LLC)。

细胞解冻与增殖

我们使用了P6A2细胞系,它是一种基于CHO的悬浮克隆,选择这个细胞株的原因在于其蛋白生产及生长特性俱佳。细胞在120毫升过滤的培养基中解冻,并放置在150毫升的转瓶内。细胞在转瓶内扩增,直到有足够的细胞来接种更大的转瓶,一直至6升。一旦培养物充分扩增,即被转移到细胞袋中接种。转瓶内的细胞密度维持在约2×105 细胞/毫升。用于扩增的培养基是带有添加剂的无血清的IS CHO-V (IrvineScientific)。我们使用了血球计数器来计算细胞数量,并利用台盼蓝染料排除分析来确定细胞活力。利用Bioprofile® 300A (Nova Biomedical)来分析细胞培养试剂。pH值是通过细胞袋探头进行在线测定,或用PHM220 pH (Meter Lab)来离线测定。氧气、二氧化碳、温度、摇速及摇摆角度是由Wave Bioreactor的控制器来测定并控制的。

细胞袋接种

细胞一般以1×105-4×105 细胞/毫升的密度接种在细胞袋生物反应器中。我们曾以更低的密度(如6×104 细胞/毫升)接种细胞,对细胞生长或生产也没有不良影响。一旦细胞在转瓶中充分扩增,就进行细胞袋生物反应器的接种。这可将转瓶的内容物直接转移到生物反应器内。在此时,生物反应器已经充满了二氧化碳和氧气,并包含温暖的培养基 (37° C)。细胞悬浮液由无菌接管连接到细胞袋,然后通过无

菌的端口泵入生物反应器中。

生物反应器里的增殖

细胞袋中的细胞能达到比转瓶更高的密度。这zui有可能是由于细胞袋内溶氧的增加,以及控制pH的能力。在转瓶中, 密度维持在2×105-6×105 细胞/毫升,加入细胞袋后, 细胞的密度增加至8×105-1×106 细胞/毫升,直到在灌流开始后,P6A2细胞克隆的密度可高达3×107 细胞/毫升。

灌流

一旦细胞达到1×106-2×106 细胞/毫升,即可开始灌流。收集用过的培养基,同时以相同速率向生物反应器中加入新鲜的培养基、养分、调控pH的缓冲液。这是由生物反应器的以重量为基础的灌流控制器来直接控制的。在这个细胞密度下每天的体积交换约为总体积的70-75%。只要细胞活力高于50%,反应器就持续灌流。一旦细胞密度达到约2×107 细胞/毫升,控制乳酸及其他毒副产物的累积就变得更加困难,反过来导致pH的控制也非常困难。到此阶段,要移除部分细胞从而维持密度在1×107-2×107 细胞/毫升。每天的体积交换提高至约100%,包括培养基、缓冲液及其他添加剂。利用孔径为0.2μm的中空纤维微孔过滤柱来灌流细胞培养上清。

通过ELISAWestern Blot进行蛋白分析

AZ-IL2B目标蛋白的定量是通过ELISA进行的。细胞培养上清是以一种专用于检测和定量AZ-IL2B嵌合体的方法来分析的。细胞培养上清中的AZ-IL2B通过与包被pIgR区域特异性抗体的微滴定板的结合而被捕获,捕获的AZ-IL2B通过生物素标记的山羊抗人IL-2多克隆抗体(R&DSystems, Inc.)来检测。链亲和素-HRP 结合物( BD Biosciences,Pharmingen)加入zui后的检测步骤中。TMB底物溶液加入反应中,与

反应中存在的酶直接反映并产生颜色变化,这种颜色变化与样品中AZ-IL2B的量成正比。利用AZ-IL2B标准曲线和质量对照来测定细胞培养上清样品中AZ-IL2B的量。根据标准的步骤来进行western blot分析7。蛋白通过8-16%Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳进行大小分离,并转移到硝酸纤维素膜上。膜与一抗——兔抗人白介素-2 的多克隆抗体( ChemiconInternational, Inc.)及二抗——碱性磷酸酶结合的驴抗兔IgG 抗体

Pierce Biotechnology, Inc.)一起孵育。

3. 每天葡萄糖和乳酸水平的化学分析。WVAWVB WVC 生物反应器运行的葡萄糖和乳酸水平。

4. 每天的蛋白浓度。三个生物反应器运行的蛋白水平的比较,以毫克/升表示。蛋白水平通过ELISA 测定。

结果

生物反应器运行WVAWVBWVC分别指的是Wave Biotech®

生物反应器20/50EH系统、200系统和1000系统。

细胞计数与活力

2显示了每种生物反应器的细胞生长和密度相当。生物反应器运行WVB没有达到WVAWVC那么高的细胞密度,但是确实达到了1.2×107 细胞/毫升。这是由于在第8天加入了高浓度的葡萄糖后导致的葡萄糖峰(图3)。1.2×10在运行生物反应器WVA后,我们发现现有的培养基配方和投料策略无法支持超过2×107 细胞/毫升以上的细胞密度。在细胞密度达到3×107 细胞/毫升后,WVA的培养物的细胞活力和细胞生长显著下降,并无法恢复,这可能是由于缺乏营养物,以及毒性物质的积累,包括培养物中的高水平乳酸(图35。氧合不是一个问题,因为我们能调节向培养物中添加的氧气量。每个反应器运行中的溶氧维持在73-100%。2×10

对于随后的反应器,在细胞密度达到1.5×107 细胞/毫升或更高,乳酸水平达2.2 /升或更高时就将部分细胞除去。通过去除细胞和调整每天的灌流量,生物反应器运行被延长,收获了更多的蛋白。WVA需要更长时间才到达灌流密度(1.2×106 细胞/毫升),这可能是由于第6天温度意外降至25° C。WVA灌流持续了13天,平均产量为12.5 毫克/升,而WVB灌流持续了18天,平均为8.3 毫克/升,比WVA多了5天,收获蛋白也多了6.7克。WVC灌流了16天,平均产量为12.2 毫克/升,比WVA多了3天,收获蛋白也增加了

16.4克。活力的增加及生物反应器运行的延长都能使产量更高。

蛋白产量

4比较了每个运行的蛋白浓度。WVA的蛋白浓度(37.5 毫克/升)比WVB15.46 毫克/升)或WVC27.91 毫克/升)更高,这是由于更高的细胞密度。每个反应器的整体蛋白产量如下:WVA 7.8克,WVB21.4克,WVC 149.2克。蛋白产量与细胞密度紧密关联。这个解释是合理的,因为存在更多的细胞,自然也有更多的细胞生产蛋白。WVB并没有达到WVAWVC那么高的蛋白浓度。这与观察到的细胞密度更低是一致的。在图5b5c中,每个反应器运行的细胞密度与蛋白浓度重叠。蛋白浓度的增加与细胞密度直接相关。在每个反应器运行终止时确定细胞活力的减少,以及蛋白产量的减少。

5. 蛋白水平与活细胞密度。细胞密度与蛋白水平的关联。A. 生物反应器运行WVA。B. 生物反应器运行WVBC. 生物反应器运行WVC

葡萄糖和乳酸浓度

每个运行中的葡萄糖和乳酸浓度在图3中显示。每个运行的水平基本相似,除了第9WVB的葡萄糖峰。由于每个反应器运行持续,细胞密度不断增加,葡萄糖被消耗,而乳酸增加。每个运行后期葡萄糖浓度的尖峰是由于当生物反应器葡萄糖水平降低至2.0 /升时,添加了50%的葡萄糖储存液而引起的。

蛋白分析

AZ-IL2B 作为一个二聚体蛋白,跑胶时分子量在36-50 kDa。图6(a)WVDWestern blot,WVD反应器的工作体积为10 升(WaveBiotech 20/50EH系统)。图6(b)WVCWestern blot,它的工作体积为500升。图中通过Western blot对第3天到第9天进行了比较,显示小型反应器与大型反应器产生的蛋白之间并无区别。

讨论

Wave Biotech的一次性生物反应器从25升放大到500升,对细胞

生长或蛋白生产没有不良影响。其他影响活力和蛋白产量的因素包括高细胞密度、不合适的添加剂浓度,以及温度波动。不仅每个系统规格所产生的蛋白水平相似,而且产生的蛋白在Western blot分析和生物活性测试(数据未显示)时也一致。每个系统的细胞生长和倍增时间也是相当的。平均的蛋白浓度与细胞密度直接相关。每个生物反应器的葡萄糖消耗量与乳酸产量是类似的。随着每个生物反应器的运行,葡萄糖水平下降,而乳酸水平上升选择一次性的生物反应器实现了生物反应器运行之间的快速转换。生物反应器的安装、接种以及处理都很轻松,因此生物反应器运行的终止以及新反应器的接种能在同一天内完成。10升、25升和100升生物反应器能在标准的8小时工作日内取下并重新接种。500升细胞袋的清空、填充以及培养基预热需要更长的时间,但生物反应器也能在28小时工作日内取下并重新接种。这个过程很简单:细胞袋清空、净化并抛弃。新的预灭菌细胞袋放置在平台上,并充入二氧化碳和氧气。添加培养基并加热,接着进行细胞接种。10升和25升工作体积的生物反应器一般从转瓶中接种。100升和500升的生物反应器则从小型

25升反应器中接种。系统从25升到500升的放大不仅简单而且成比例,只需对体积变

化做出调整。而培养基配方或添加剂则无需改变。细胞系在25升、100升和500升反应体系中以相似的方式增殖和生产。

6. 两个生物反应器运行的Western blot 分析。A. 生物反应器运行WVD 的工作体积为10 升。

B. 生物反应器运行WVC 的工作体积为500 升。MWM=分子量标准。

结论

成功的灌流工艺是在培养物健康与zui佳产量之间达到平衡。适合zui佳的细胞生长和对生长有利的因素可能对生产不利。例如,增加灌流速率以去除毒性物质会将产物稀释到很低的浓度,为下游处理带来不便,更不用说与灌流增加相关的商品费用增加。对培养基成分、添加剂以及投料策略的调整可能会增加灌流的天数,而不稀释蛋白的浓度水平。有报道在生物反应器运行中采用两种不同的培养基配方来控制细胞代谢可降低细胞生长,同

时维持其活力,从而延长收获产物的天数1。从生物反应器中去除细胞也是一个选择,我们将它加入工艺中来控制细胞密度。这很难频繁处理,并增加了生物危害的废料。如果一

种培养基配方能支持早期的快速细胞生长,然后在生产中控制细胞生长,那是zui理想的。

一次性的生物反应器比反复使用的生物反应器在清洗、灭菌、验证、安装和运行之间的转换时间上更具优势。我们证明了25升、100升和500 工作体积的系统运行在细胞生长、蛋白产量、葡萄糖消耗以及乳酸生产上是相当的。

文章来源:BioProcessing™ 杂志

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